多能干细胞是一种能够分化成内胚层，中胚层，外胚层三个胚层能力的细胞。目前有四种技术可获得多能干细胞，分别为体细胞核转移技术、体细胞与多能干细胞融合技术、利用多能干细胞提取物诱导技术、及诱导性多能干细胞技术。1996年7月Wilmut 虽然通过体细胞核转移技术培育出世界上首例哺乳动物“多莉羊”，使治疗性克隆有了实质性进展，但是体细胞核移植技术形成胚胎和个体发育的低效使其应用受到很大限制，而体细胞与多能干细胞融合技术、及利用多能干细胞提取物诱导技术还不成熟，效率很低，因此也无法得到广泛应用。
1iPS细胞概述诱导多能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，使体细胞核重编程后多能性基因发生表达，从而体细胞被逆转为具有多向分化潜能的细胞技术。2006 年8月,日本京都大学Yamanaka研究小组首先利用逆转录病毒作为基因导入载体，将4个与多能性有关基因Oct4、Sox2、c\|myc、Klf4转染到小鼠成纤维细胞中，然后，利用转染后细胞表达多能性标志分子Fbx15 作为细胞筛选标准,最终得到了与胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ES）特性相似的多能性干细胞，并命名为“诱导性多潜能干细胞(Induced Human Pluripotent Stem Cell,iPS Cell)” \[1\]。2007年11月，Yamanaka小组采用了逆转录病毒导入Oct4、Sox2、c\|myc、Klf4 四种基因组合将人皮肤成纤维细胞诱导成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞\[2\]。2007年12月，Thompson实验室则利用自己的方法筛选出4种基因分别是Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，并以慢病毒为载体将4种基因导入人类新生儿成纤维细胞，使其发生细胞核重编程后被诱导为iPS细胞\[3\]。随后的一些研究进一步证实了人或小鼠的体细胞能被诱导为多潜能干细胞状态\[4\]。最近，中国科学院动物研究所周琪院士和上海交通大学医学院曾凡一研究员领导的研究组，首次利用鼠iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第1次证明了iPS细胞的全能性，这一研究成果表明iPS细胞可以替代胚胎干细胞用于多种疾病的治疗\[5\]。近年来iPS细胞之所以成为研究的热点，一方面是回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的政治和伦理学争论，另一方面为再生医学、新药筛选、药物毒理研究等领域提供了广阔的研究空间和应用前景。本文将从iPS细胞系建立的一些重要环节、iPS细胞的临床应用价值和发展前景等方面进行综合评述。
2建立iPS细胞的重要环节
21体细胞及转染基因选择2006年8月,Yamanaka研究小组首先利用4个多能性有关的基因Oct4、Sox2、c\|myc、Klf4导入到小鼠成纤维细胞中，诱导得到了与胚胎干细胞特性相似的iPS细胞\[1\]。随后的研究进一步证实被逆转的iPS细胞可以是任一胚层来源的细胞，也可以来源于胚胎、新生儿、成人或是终末分化的细胞，只是不同来源细胞或不同发育阶段细胞逆转为iPS细胞的难度、效率、基因组合及细胞克隆所需时间不同。根据不同种类的体细胞选择相应的转录因子组合，一般有两种组合方式，Oct4、Sox2、c\|Myc、Klf4组合或Oct 4 、Sox2、Klf4组合均可将体细胞重编程为iPS细胞。前一种转录因子组合较后一种转录因子组合效率要高，而添加小分子化合物可有效提高重编程效率，并减少转录因子的应用，如添加维生素C可显著提高人或鼠iPS细胞产生效率，而在培养液中加入小分子化合物BIX或PD0325901与CHIR99021，则可显著提高iPS细胞重编程效率。
22基因转染方式目前有4种基因导入方式，分别为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和转座子介导方式均可将目的基因转染入体细胞，进而将已分化成熟的体细胞重编程为iPS细胞。2006 年8月,日本京都大学Yamanaka研究小组首先利用逆转录病毒作为载体，将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞\[1\]。2007年12月，Thompson实验室以慢病毒为载体将4种基因导入人类新生儿成纤维细胞，使其发生细胞核重编程后被诱导为iPS细胞。2008年3月Stadtfeld M等成功的利用腺病毒作为载体，将Oct4、Sox2、Klf、c\|Myc基因导入到小鼠的成纤维细胞和肝细胞，诱导出iPS细胞。2009年3月Kaji K和Woltjen 同时利用转座子作为载体诱导出iPS细胞。最初的研究是一个慢病毒或逆转录病毒载体只携带一个多功能基因，采取“ 直接混合”或“ 先分后混”的方案感染细胞，而携带一个多功能基因的慢病毒载体只能用后一种方案。Okjta K等成功构建了携带3种多功能基因的腺病毒载体，最近，有学者成功构建了携带4种转录因子基因的腺病毒载体和慢病毒载体，而Kaji和Woltjen将4种转录因子基因克隆于同一载体中，亦成功构建了转座子表达载体，这将使生产和感染病毒更加简单、简捷和方便。
23iPS细胞筛选(1)基因表达筛选：① 激活Fbx15筛选：Yamanaka 等人选用Fbx15 作为筛选iPS细胞的报告基因，利用同源重组技术将β\|geo序列插入到小鼠 Fbx15 序列中,导入3天后,当 Fbx15 被激活时,细胞能产生抗性从而对普通剂量的G418 耐受而存活下来，利用这种筛选策略得到的细胞集落具有小鼠 ES细胞的部分特征\[1\]。② 激活Oct4和Nanog筛选：Maherali\[4\]、Okita K \[2\]等小组选用对多能性更为关键的基因Nanog或Oct4作为报告基因,得到的 iPS细胞具备更多 ES 细胞的特性。进一步比较了Nanog和Oct4的筛选效果,发现利用Oct4选出的iPS细胞比利用Nanog选出的iPS细胞在数量上少了很多,但前者获得 ES 特性细胞比后者多，表明在作为评判多能性的标准方面,Oct4的激活比Nanog的激活更为严格。（2）细胞形态学改变筛选：Maherali\[4\]等人依靠细胞形态学筛选就可能建立iPS细胞系。Meissner\[6\]发现以细胞形态学为标准，在第11天和16天时挑选出ES样细胞克隆，经历1～3次传代，就可以从细胞形态学改变挑选出iPS细胞，而iPS细胞也能够稳定的表达Oct4和Nanog。 Meissner\[6\]和Qin D\[7\]的研究证实仅利用形态学的标准对细胞进行筛选也能够分离出小鼠的 iPS 细胞。Takahashi K\[1\]和Yu J\[3\]利用这一形态学筛选策略从人类体细胞中成功的诱导出了 iPS 细胞。
24iPS细胞鉴定iPS细胞具有自我更新和分化潜能，比如在形态学、表观遗传学特征、基因表达谱、生长特性、及参与生殖系发育方面与 ES 细胞基本一致。iPS细胞鉴定具体包括以下几个方面：（1）细胞表型和表面标志的鉴定：Takahashi K \[1\]等发现应用慢病毒载体感染人成纤维细胞第25天后，得到高核质比、有明显核仁、细胞克隆为圆形、培养和增值条件都与ES细胞相似，这些都是ES细胞的典型特征。Takahashi K\[1\]和Yu J\[3\]利用流式细胞和免疫组化技术通过鉴定iPS细胞表达多能干细胞特异性的表面标志SSEA\|1、SSEA\|3、SSEA\|4、TRA\|1\| 60、TRA\|1\|81和TRA\|2\|49/6E等来对iPS细胞进行判断，而这些特异性的表面标志蛋白在转染前的成纤维细胞并不表达。Hanna J\[8\]发现iPS细胞内端粒酶活性上升到近似ES细胞的水平，而端粒酶活性与细胞多能性有密切关系。此外，利用RT\|PCR技术也能鉴定出大量ES细胞特异转录物，如 Oct4、Sox2、Rex1、Dppa2、Dppa4、Utf1 和 Nanog等。（2）表观遗传状态的鉴定：小鼠和人iPS细胞重编程后，Oct4、Rex1 和 Nanog等重要多能基因的启动子区从高甲基化转变为类似 ES细胞的低甲基化状态，表明这些启动子处于转录活性状态，而Takahashi K\[1\]等发现重编程前后 Oct4 和Rex1启动子的活性差异可被荧光素酶报告基因所证实。（3）基因表达模式和染色体状态：全能iPS细胞与ES细胞的基因表达高度相似，而部分重编程iPS细胞则显示了不同类型的干细胞相关基因表达模式。Yu J\[3\]发现雌鼠iPS细胞的X染色体被重新激活后，将拥有雌性ES细胞特有的两个活性X染色体，在分化过程中又随机失活。（4）发育潜能的鉴定：小鼠、人胚胎和成体来源的iPS细胞注射到裸鼠皮下，均可获得有三胚层细胞的畸胎瘤。iPS细胞不同克隆形成的畸胎瘤有不同分化倾向，同样条件下有的克隆倾向于分化为神经和骨组织，而Yu J\[3\]发现由于Oct4和Nanog不能下调，导致另外一些iPS细胞分化为原始肠组织和未分化柱状上皮组织。我国科学家周琪院士\[5\]和国外学者Michael\[9\]利用小鼠iPS细胞成功的克隆出具有繁殖能力的小鼠，进一步证实了iPS细胞的全能性，表明iPS细胞可以替代胚胎干细胞用于治疗多种疾病。
3iPS细胞临床应用前景
31iPS细胞临床应用iPS细胞的建立充分证实了已分化成熟的人类体细胞可以被重编程后转化为ES细胞，避免患者免疫排斥反应和长期以来争论不休的伦理问题，而成功建立 iPS 细胞,并应用 iPS 细胞来治疗疾病是人类的最终目标。Hanna\[8\]等人率先在小鼠中用鼠iPS细胞治疗镰刀形红细胞贫血症。Xu\[10\]等人将iPS细胞分化来的内皮前体细胞移植到血友病A的小鼠肝脏中,有效的改善了病鼠出血不止的症状。Raya\[11\]等人对遗传修饰后的 Fanconi 贫血症病人的成纤维细胞进行重编程,并获得了基因修饰后的Fanconi贫血症病人特异性iPS细胞,且这些iPS细胞能够分化形成表型正常的髓系和红细胞系的造血祖细胞，这项研究进一步证明了iPS细胞在临床治疗上的应用价值。在神经系统疾病和心血管系统疾病的治疗中,iPS细胞也有广泛的应用前景。Wernig\[12\]等人通过体外培养将iPS细胞分化为神经前体细胞,并形成神经元和神经胶质细胞，将iPS细胞衍生的神经细胞移植入胎鼠脑中,这些细胞可整合进受体鼠的脑中,形成神经胶质细胞和神经元细胞,包括谷氨酸能、GABA 能、儿茶酚胺能的各亚型神经元细胞，该实验证明了用 iPS 细胞进行细胞替代疗法治疗神经系统疾病的可行性。Narazaki\[13\]等人分别将小鼠和人的 iPS细胞分化为多种心血管细胞,如血管内皮细胞、淋巴内皮细胞和心肌细胞,验证了 iPS 细胞在治疗心血管疾病上的潜在应用价值。
32建立疾病iPS细胞系iPS细胞技术为某些疾病的研究提供了一种新的途径，人们可以利用这项技术建立病人来源的iPS细胞系用于疾病发病机理的研究。Park等人将腺苷脱氨酶缺乏相关性重度联合免疫缺陷症综合征、Gauchers病、杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、亨廷顿病、Lesch\|Nyhan综合征、唐氏综合征、21三体综合征、帕金森病和青少年起病的I型糖尿病患者的体细胞诱导为iPS细胞。有报道将iPS细胞分化形成具有胰岛素分泌功能的类胰岛细胞团,将帕金森氏综合症患者皮肤成纤维细胞转化为iPS细胞,将脊髓性肌萎缩症患儿的皮肤成纤维细胞诱导为iPS细胞，将肌萎缩性脊髓侧索硬化症的老年患者皮肤成纤维细胞诱导成为iPS细胞，然后分化为运动神经元细胞，用于该疾病发病机理的研究。
4展望建立iPS细胞是2007年最重要的科技进展之一，曾被科学界认为这项成就犹如莱特兄弟发明飞机一样。iPS细胞技术现已成为生命科学领域研究和探讨的焦点，为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望，但是，在iPS细胞应用于临床治疗之前，还会面临着许多问题：(1)iPS细胞安全性：获得iPS细胞的主要方法是将4种基因通过病毒诱导的方式转染到体细胞核内，而作为载体的病毒和被导入的基因都具有致癌的潜在风险性，需要加以有效防范。(2)iPS细胞的制备效率低：获得 iPS 细胞的效率大约在万分之几到千分之几之间,可能的原因是被导入基因的手段效率低、能被诱导为iPS 细胞来源有限等原因。(3) iPS细胞和ES细胞在细胞生物学特性、遗传特性和定向分化机制等方面是否具有显著性差异，还需要进一步深入研究。虽然目前还有许多问题有待解决，但是，iPS细胞为干细胞研究提出了新的思路和研究方法。可以预见研究及应用iPS细胞，将会是生命科学领域的一个重要方向，而上述的不足会在人们的努力下被克服，最终，iPS细胞将为治愈人类许多疾病带来新的希望和契机。

\[1\]Takahashi K,Yamanaka SInduction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors\[J\]Cell,2006,26(4):663\|676
\[2\]Okita K,Ichisaka T,Yamanaka SGeneration of germline\|competent induced pluripetent stem cells\[J\]Nature,2007,448 (7151):313\|317
\[3\]Yu J,Vodyanik M A,Smuga\|Otto K,et alInduced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells\[J\]Science,2007,318(5858):1917\|1920
\[4\]Maherali N,Sridharan R,Xie W,et alDirectly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution\[J\]Cell Stem Cell,2007,1(1):55\|70
\[5\]Zhao XY,Li W,Lv Z,et aliPS cells produce viable mice through tetraploid complementation\[J\]Nature,2009,461(7260):86\|90
\[6\]Meissner A,Wernig M,Jaenisch RDirect reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells\[J\]Nat Biotechnol,2007,25(10):1177\|1181
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\[9\]Michael J,Boland1,Jennifer L,et alAdult mice generated from induced pluripotent stem cells\[J\]Nature,2009,461(7260):91\|94
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