结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MT）是一种生长缓慢，抗酸阳性的棒状杆菌。它可侵犯全身各器官，从而引发全身多系统疾病，以肺结核最为多见。结核分枝杆菌不易杀灭，少量的结核分枝杆菌可长期潜伏在宿主体内，在一定条件下又可以恢复为具有活力的原生结核杆菌，从而再次导致结核病的发生\[1\]。目前，全球大约有1/3的人感染MTB，其中5%～10%的感染者最终发展成为结核病患者。我国是全球结核病流行严重的22个国家之一。因此，在结核病治疗的初期，准确、快速、可靠的检测，对临床结核病的治疗具有不可估量的重要意义。
1结核分枝杆菌细菌学检测
11分枝杆菌快速培养法研究发现,结核杆菌繁殖由于受STPK(Ser/tHR蛋白激酶包括PknA\\PKnB\\PKnd)的控制，因其经常处于休眠状态和稳定期，因此生长较为缓慢。目前，对结核分枝杆菌进行快速培养主要有BACTEC\|TB460分枝杆菌快速培养仪和BACTEC\|TB 960分枝杆菌全自动快速培养仪这两种仪器。BACTEC\|TB460分枝杆菌快速培养仪是一种专门针对结核杆菌生长缓慢而研发的仪器，它是以放射性14C棕榈酸为特殊碳源的液体培养基来培养结核分枝杆菌，在培养过程中结核分枝杆菌消耗碳源，产生放射性CO2，其放射性强度与MT的生长相关，检测标本中MT只需4～25天。此外，在BACTEC系统内加入P\|硝基\|a\|乙酰氨基\|β\|羟基苯丙酮（简称NAP）继续培养2～6天后，根据其生长指数还可初步鉴别MT复合群和非结核分枝杆菌（简称NTM)，目前在国内外已成为结核病诊断的标准参照系统之一。BACTEC \|TB960分枝杆菌全自动快速培养仪，功能与BACTEC\|TB460相似，只是其又在培养管中加入含有RUTHENIUM的荧光底物，检测标本经前处理接种于该培养管后，如有分枝杆菌存在，其代谢产物可激发底物RUTHENIUM产生荧光，经扫描后可以自动显示出以生长指数（GI）为表示的测定结果。
12噬菌体药敏法活的MT可以保护菌体内的噬菌体免受噬菌体杀灭剂作用，从而将结核分枝杆菌与噬菌体共同孵育。噬菌体侵入结核分枝杆菌后大量繁殖，结核分枝杆菌被抗结核药物处理时,若结核分枝杆菌耐药,则细菌能存活，加入噬菌体杀灭剂，位于菌体内部的噬菌体不能被杀死。因此对其进行再培养后,菌体会释放出噬菌体，从而在琼脂培养基上有噬菌斑的出现。该法与传统药敏试验法符合率高，可对标本直接进行检测，无需特殊仪器，只需3天时间，且操作简单。
13噬菌体生物发光法将含虫荧光素酶表达基因F\|flux插入分枝杆菌噬菌体，当F\|flux重组噬菌体进入相应的分枝杆菌体后，在活菌体内增殖，同时F\|flux基因表达产生虫荧光素酶。重组噬菌体表达的虫荧光素酶在体外发光体系中与虫荧光素及其他因子混合后，虫荧光素酶即可与荧光素作用而发光，发光强度与荧光素酶的含量呈正比。从而定性和定量地分析相应的分枝杆菌存活率及其数量。
2分子生物学检测方法
21菌种鉴定法PCR是一种根据DNA复制原理而设计的DNA或RNA体外扩增方法。研究人员根据MT的重复序列、蛋白编码基因以及16SrRNA基因设计出多种特异引物，通过体外扩增所产生的特异性片段即可简便、快速、灵敏、特异地从多种临床标本中检测出MT的DNA，且只需1～2天时间，但在检测过程中应注意假阳性和假阴性问题。目前已有多种商品化的MT\| PCR试剂盒。
22PCR\|直接测序鉴定法标本的16S rRNA或65000（相对分子质量）抗原基因可用分枝杆菌属特异的引物对其进行PCR特异性扩增后进行测定，比较核苷酸的差异性，从而鉴定出菌种。目前该方法由于技术要求高，仪器特殊、昂贵，所以难以推广。
23PCR\|DNA探针鉴定技术DNA探针是一种能识别特异核苷酸序列、带标记的一小段DNA分子。分子杂交是其检测的主要方法。目前，研究人员将DNA探针和PCR技术结合，发明了多种MT IS6110DNA、16S、16S\|23S间隔区rDNA片段探针以及寡核苷酸探针，建立了菌落杂交、斑点杂交、Southern杂交、微孔板杂交和原位杂交等方法，检测的敏感度和特异度都得到了显著提高。
24PCR\|限制性片段长度多态性（PCR\|RFLP）鉴定法PCR\|RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物、对标本中分枝杆菌65000蛋白编码基因、16S或16\|23S rDNA进行体外扩增，然后用不同的限制性内切酶对扩增片段进行消化，最后通过电泳分析酶切图谱对菌种进行鉴定。
25PCR基因芯片鉴定法基因芯片技术是一种将大量核酸分子以高密度微阵列方式固定在载体上，从而检测出带标记的待测样品DNA的方法。如果扩增产物与探针序列完全匹配则结合较为牢固则杂交信号较强；反之，如果有单个或多个碱基错配则信号较弱。这是一种通过比较是否有突变的探针杂交信号得到结果的大规模分析遗传差异新方法\[2\]。
26随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)分析此项技术是利用一条人工合成的寡核苷酸引物对整个DNA链进行探察，于足够近的间距(200～2000 bp)内,在较低的温度下与匹配或部分匹配的退火位点结合，从而扩增出多态的DNA片段。如果DNA链之间存在差异，产生的DNA片段数量及长度就会不同，经电泳将这些产物分开后,可得到多态性很好的DNA指纹图谱,进而可以分型鉴定\[3\]。
3免疫学诊断研究
31体液免疫诊断
311体液标本抗结核抗原诊断应用酶联免疫吸附测定（ELASA）法检测患者血清中结核特异性抗体，尤其是对菌阴肺结核、肺外结核、小儿结核病的诊断与鉴别具有重要意义。但是由于结核病患者的免疫功能存在个体差异，其对MT抗原识别也有差异，此外结核病患者对抗原的识别存在阶段特异性，从而导致目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，结核患者的抗体反应是针对许多MT抗原的。因此，筛选多个纯化的结核病的特异性抗原组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向\[4\]。
312体液标本抗结核抗体诊断结核菌素和纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验是最常用、最简便的一种结核分枝杆菌感染诊断方法。PPD是一种非常复杂的混合物，其包含多种分枝杆菌共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别其是因为MT复合群感染还是接触环境中NTM或卡介苗接种后造成的致敏，只能根据机体的反应强弱辅助诊断。目前国内、外学者通过动物模型或临床试验研究纯化抗原、合成多肽和重组蛋白，筛选致病性结核分枝杆菌表达而BCG不表达的、诱导皮肤迟发型变态反应（DTH）的特异抗原，以期建立新的结核皮肤诊断试剂。
32细胞免疫诊断
321双抗体夹心ELISA检测细胞因子水平近年研究显示活动性肺结核、结核性胸膜炎或脑膜炎患者血液或局部组织的T淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞在MT抗原的激活下，释放可溶性白细胞介素2（IL\|2）受体、膜IL\|2受体、γ\|干扰素(IFN\|γ)、α\|肿瘤坏死因子、IL\|18和IL\|8的水平不同，与正常人或非结核性疾病差异有显著性。
322T\|淋巴细胞增殖试验和T\|细胞亚群分析MT特异的蛋白抗原（如ESAT6、CFP10蛋白等）可刺激结核分枝杆菌感染的人外周血单个核细胞（PBMC）生成大量的IFN\|γ。可通过酶联免疫斑点试验（ELISPOT）法检测分泌IFN\|γ的外周血T淋巴细胞，从而建立新的灵敏度高、特异度强的诊断结核分枝杆菌感染特异性方法\[5\]。由于结核病患者细胞免疫功能明显紊乱，其外周血CD3+、CD4+淋巴细胞下降，CD8+ T淋巴细胞增高，CD4+/ CD8+比值降低，并伴有T细胞活化功能障碍，尤其是对于活动性结核病患者更为显著，而且结核性胸腔积液中淋巴细胞比例、CD4+ T淋巴细胞也显著升高。分析T细胞亚群的变化有助于结核性和癌性胸腔积液的鉴别。
4色谱技术诊断研究结核分枝杆菌细胞中各种组分及含量可以通过高效液相色谱检测，可依据此对结核分枝杆菌分类进行鉴定，而且还可以检测体液中分枝杆菌代谢产物，进行结核性脑膜炎和胸膜炎的病原学诊断。
5结语综上所述可见常规细菌学检查由于其直观、简便、价廉等优点,仍将是重要的实验诊断手段。但是分子生物学技术的迅猛发展，其在结核病的临床诊断目前在临床应用上也有所突破，必将成为结核病诊断的里程碑。总之，随着结核病研究的不断深入，结核病的诊断必将会得到不断发展和完善。

参考文献\[1\]李恒德，左建宏，王麓山结核分枝杆菌耐药机制研究进展\[J\]现代生物医学进展，2013,(13)11:2175\|2180
\[2\]张江峰,张亚丽,曾照芳PCA技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变\[J\]激光杂志，2013，2(34):91\|94
\[3\]武晓林，方维焕，俞盈，等结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用\[J\]2012,52(9):1151\|1159
\[4\]刘冰，陈华根免疫学检测在结核病诊断中的应用\[J\]检验医学与临床，2013,15(10):2027\|2028
\[5\]许文炯，王燕，石利民,等酶联免疫斑点实验与蛋白芯片检测结核分枝杆菌免疫应答的研究\[J\]中国卫生检验杂志，2013,3(23):673\|676