结核病（tuberculosis），又被称为白色瘟疫，是一种由单一致病菌\|结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的死亡率极高的慢性传染病，其临床诊断和治疗的历史源远流长。在人类社会同结核病斗争的历史长河里，每一次取得的关键性进步都是以结核病诊断和治疗技术方面的重大进展为标志的。从1882年德国科学家罗伯特·科赫发现了结核分枝杆菌，到后来结核菌素及细菌学、分子生物学检测技术等方面所取得的成就，都为结核病的临床诊断注入了更大的活力\[1\]。近年来，结核病疫情呈现全球性回升趋势，引起了国际社会的高度关注，世界卫生组织已经把结核病作为重点防控的恶性传染病之一，将其防控类别由二类上升至一类\[2\]。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病疫情十分严重，呈高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率等特点。准确及时诊断结核病，有效地控制传染源，对预防结核病至关重要。本文就近年来临床上常用结核分枝杆菌的检测方法做一概述。
1细菌学诊断
11涂片法目前结核病的涂片检查主要通过分泌物染色镜检，镜下寻找结核分枝杆菌。常用染色方法主有抗酸染色和荧光染色。(1)抗酸染色法:痰涂片抗酸染色寻找抗酸杆菌是应用历史最久，也是临床最常见细菌学方法，是发现结核分枝杆菌的直接手段\[3\]，具有操作简便、快速、价廉等特点。目前常用萋～纳氏抗酸染色法，一般需标本中存在103/ml个细菌才有15%～30%的阳性率，灵敏度较低，操作繁琐，特异性差，无法区分死菌和活菌，对早期非排菌感染者的诊断不适用，易造成患者的漏诊。有研究报道用N\|乙酰\|L\|半胱氨酸或苏糖醇来进行痰的前处理，取得了较好的检测结果;(2)荧光染色法:以金胺O为代表的荧光染色法提高了镜检的灵敏度，此法检出率比一般镜检高，且检测时间短，尤其适用于含菌量少的病例，染色后结核分枝杆菌在荧光显微镜下呈金黄色荧光\[4\]。但该法的缺点是假阳性率较高，保存时间短（＜4个月），因此阳性结果一定要培养确认，在未开展培养的单位不用该法为宜;(3)LED显微镜法:LED显微镜是近年来研制的一种将显微镜与发光二极管相结合的新型荧光显微镜，其价格低廉，且不需要暗室，使用方便，被WHO推荐取代传统的荧光显微镜\[1\]。Minion等人\[5\]对使用LED荧光显微镜和传统的荧光显微镜检测抗酸杆菌进行了比较，结果显示两种显微镜检测抗酸杆菌的灵敏度和特异度差异均无统计学意义，但传统荧光显微镜观察1张涂片平均需要151 min，而LED荧光显微镜仅需112 min，所需时间明显缩短。
12培养法(1)传统培养法:采用罗氏培养法，是目前检测结核分枝杆菌的“金标准”，在结核病细菌学诊断方面具有重要意义，是辨别死菌、活菌的可靠方法，可作为化疗反应的监测指标，其药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用\[5\]。缺点是培养耗时过长，阳性率低，特异性差，各种分枝杆菌均可生长，需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验来进一步确定是否为结核分枝杆菌;(2)BACTEC检测系统:该法为放射同位素液体培养法，采用液体培养基和灵敏检测微量生长的自动化技术，根据抗酸分枝杆菌在代谢过程中分解脂肪酸产生CO2这一特性而设计。BACTE 460 TB是最早应用于临床的快速检测系统，但因该法使用放射性底物易对环境造成放射性污染现已被各种非放射性检测技术逐步替代。Becton Dickinson微生物实验室推出的BACTEC\|MGIT 960全自动分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统以荧光显示耗氧量替代了BACTE 460 TB的放射线检出，避免了环境污染，阳性标本检出时间明显缩短，阳性标本检出率较常规培养法提高了10%，较BACTE 460 TB法提高了4%左右;(3)MB/Bact系统:MB/Bact系统由比利时Organon Teknika公司开发的一种液体培养基系统，位于培养孔底部的反射光度计可连续监测培养瓶中CO2产生时感应器的颜色变化，从而反映培养系统中分枝杆菌生长情况。有报道认为MB/Bact系统能够快速、敏感、有效的分离标本中结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但该系统价格昂贵且污染率高;(4)分枝杆菌生长指示管法（MGIT）:Becton Dickinson微生物实验室经过不断研究，研发出一种新型的非放射性培养法，即分枝杆菌生长指示管法（MGIT），通过荧光淬灭氧传感器使指示剂发挥在有氧的情况下发生荧光淬灭的特性，管底培养物在紫外灯照射下出现亮橙色荧光则为生长。该方法的检出时间与BACTEC 460TB相似，但发现率稍高。
13药物敏感试验抗结核分枝杆菌药敏试验是临床医生指导结核病患者用药、制定治疗方案的重要依据。WHO把比例法作为药敏试验的“金标准”，而部分国家仍然沿用绝对浓度法进行药敏试验。WHO委派专家对WHO认可的一线及二线抗结核药物药敏试验方法诊断的准确性和可重复性进行研究，研究结果支持商业化液体培养检测系统建议的使用绝对浓度法检测异烟肼和利福平的结论，而使用绝对浓度法检测乙胺丁醇和链霉素药敏试验结果是否准确还有待进一步研究分析，目前尚缺乏评价吡嗪酰胺和二线药物药敏试验结果的资料。近年来不断涌现出许多抗结核分枝杆菌药物药敏快速检测的新方法，如显微镜观察药物敏感度法(microscopic observation drug susceptibility，MODS)、噬菌体裂解法(Phage Splitting Assay,PSA)快速鉴定结核分枝杆菌\[6\]、噬菌体生物扩增法\[7\]、微孔板硝酸还原酶检测(microplate nitrate reductase assay,MNRA)等。此外，L型分枝杆菌的研究也受到重视，为菌阴结核病的诊断拓宽了新的思路。
2免疫学诊断
21细胞免疫学诊断(1)结核菌素试验(OT试验):结核菌素试验是常用的结核病辅助诊断方法，主要用来辅助诊断结核病、观察卡介苗的接种效果以及细胞介导的免疫应答反应的检测。结核菌素试剂分为旧结核菌素（OT）和纯蛋白衍生物（PPD）两种\[8\]。目前常用纯蛋白衍生物进行检测。随着人们对PPD试剂的不断深入研究，鉴别结核分枝杆菌感染与非结核分枝杆菌感染一取得了实质性的进展。PPD试验可在早期对结核病做出诊断及鉴别诊断，是临床上一种重要的检测细胞介导免疫应答的方法;(2)γ\|干扰素释放试验(interferon\|gamma release assays,IGRAs):该试验通过对全血或单核细胞在受到结核杆菌特异性抗原刺激后产生γ\|干扰素来进行检测，对判断机体是否存在潜伏结核感染及建立临床辅助诊断方法具有指导意义。但该方法需将单核细胞从血中分离出来，使其应用受到限制;(3)腺苷脱氨酶(ADA)测定:ADA及其同工酶活性的测定有助于各种结核病的诊断和鉴别诊断。
22体液免疫学诊断(1)结核抗原测定:结核特异性抗原（TB\|SA）对结核分枝杆菌的感染具有特异性，能排除人群接种卡介苗对实验结果的影响，有效控制假阳性。测定血清TB\|SA抗体浓度有助于筛选痰抗酸染色阴性的肺结核患者，有助于肺结核患者治疗的疗效监测。临床上常用于结核病血清学检测的抗原有：38kD蛋白(抗原5)、Ag85B、ESAT\|6、CFP10、MPT64、A60抗原等。一些学者还主张联合采用几种敏感性高和(或)特异性强的抗原，以提高血清学诊断的敏感性\[9\];(2)结核抗体测定:主要检测血清中的抗38kD抗体和抗LAM抗体。该方法阳性率在70%以上，其测定的敏感性和特异性因病例选择、标本种类、测定方法和所用抗原的不同差异较大。同时，血清结核抗体测定还被用作器官移植术后并发结核感染的监测指标。
23血清学检测技术(1)酶联免疫吸附试验(ELISA):1976年，ENassau等人首次采用ELISA技术检测对肺结核患者血清中结核分枝杆菌抗体进行检测，敏感性和特异性均较好，是目前研究最多、应用最广的血清学诊断方法;(2)斑点免疫金渗滤法(dot immunogold filtration assay,DIG\|FA):该方法是在ELISA基础上发展起来的固相免疫标记测定技术，所需抗原量少，较ELISA更为简单、快速\[10\]。该方法包被所需的抗原量少，检测的敏感性和特异性与ELISA法相当，结果易于判读，能进行单个标本的测定，可广泛推广应用。
3分子生物学诊断
31多重PCR(multiplex PCR)检测技术PCR技术可在短短数小时内完成对临床样本的检测。多重PCR检测技术针对靶基因多个位点设计多种引物进行扩增，可避免假阴性结果。Chia等\[11\]开发了一种改良的多重PCR技术，针对16S\|23SrDNA、热休克蛋白65和ESAT\|6设计了9对引物，结果显示，抗酸杆菌涂片＋＋＋、＋＋和＋标本中该方法发现结核分枝杆菌的阳性率分别为98%、95%和53%。改良的多重PCR可节约时间，适合在结核病高发国家应用。
32实时荧光PCR技术实时荧光PCR技术是一种全新的PCR分子杂交模式，使PCR扩增、荧光探针杂交、检测一体化，在单一管内即可完成，其简便、快速、敏感性较高、特异性强，有效的解决了PCR的污染问题，可广泛应用。
33恒温扩增检测技术恒温扩增检测技术包括RNA恒温扩增实时检测(si\|multaneous amplificationand testing,SAT)和环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)等\[12\]。SAT是基于RNA恒温扩增技术发展起来的一项最新核酸检测技术，是国内自主专利技术，其检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利于用药之后疗效的监测，以及对是否治愈进行判断，整个过程耗时15 h。LAMP是一种新型的核酸扩增技术，该技术可直接扩增临床标本中的结核分枝杆菌DNA，等温扩增，肉眼即可就可以观察结果，整个过程约需大约1 h。SAT和LAMP两种方法用于检测结核分枝杆菌具有操作简便、快速、敏感、特异等优点，是两项很有市场前景的新技术。
34基因芯片技术基因芯片以杂交原理为基础，将待测核酸与一组已知序列的核酸探针杂交，通过检测杂交信号的强度来获得待测核酸的核酸序列\[13\]。基因芯片主要用于基因检测工作，可一次性对标本大量序列进行检测和分析，适于基因表达、基因功能及基因分型等方面的研究。将该法应用于结核杆菌耐药基因突变检测，具有快速、敏感的优点，对指导医生正确用药和控制疾病的传播有重要意义。
35Xpert Mtb/RIF技术Xpert Mtb/RIF技术是美国的Cepheid公司以结核分枝杆菌核酸扩增为基础研发的一套全自动分子诊断方法\[14\]。该技术是集痰标本处理、核酸提取、扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测、利福平耐药基因突变检测于一体的结核病和耐药结核病快速诊断方法，全过程只需90 min，即可同时实现结核分枝杆菌和利福平耐药的检测，整个过程在封闭的室内自动化完成，无需生物安全需求，是WHO在2011年重点推荐的技术之一。
36分子线性探针测定法(molecular line probe assays)分子线性探针测定法即耐药结核分枝杆菌基因分型技术(Geno\|Type MtbDR)诊断耐多药型结核病已得到了WHO的认可与推荐。最近，一种新型分子线性探针测定法\|GenoType MtbDRsl试验快速检测乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物和二线注射类药物的耐药性已用于诊断广泛耐药型结核病，该方法进行耐药性检测费时较短，用于检测氟喹诺酮类和乙胺丁醇耐药的敏感度较好，也可用于早期检测卡那霉素、卷曲霉素的敏感度。
4总结近年来，随着人们对结核分枝杆菌研究的深入研究，一些新的检测方法不断涌现出来。在临床，细菌学检测仍不失为诊断结核病的常用方法。痰涂片镜检是确诊的依据，但其阳性率较低。结核分枝杆菌培养仍作为结核病诊断的金标准，但其耗时较长。血清学方法是结核病诊断的重要辅助手段，但其缺乏敏感性和特异性均高的单体蛋白作为血清学检测结核病的特异性抗原。核酸扩增方法具有敏感性高、特异性强、快速等优点，但不能鉴别细菌的死活。基因芯片技术是目前最前沿的分子生物学诊断技术，该法用于结核杆菌耐药基因突变的检测，具有快速、敏感的优点，但操作技术要求较高，一般实验室无法开展。显然，各种检测方法都存在各自的特点，也有不同程度的缺陷。因此临床诊断结核病需结合多种检测方法，做到结核病的早发现、早诊断以及早治疗。目前，许多结核病临床诊断新技术正处于由实验室向临床试用的重要转折阶段，还面临很多问题，如解决操作的规范化、试剂的标准化及临床意义的界定等。随着科技的不断发展，各种结核病的诊断技术更趋快速、敏感和特异。相信结核分枝杆菌的临床检测会进入一个崭新的阶段。

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