人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）属于乳头瘤病毒科的乳头瘤病毒属，为球形无包膜的环状双链DNA病毒，直径为52~55 nm。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变，包括宫颈上皮内低度病变（CINⅠ）；高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN Ⅱ/Ⅲ）的发生相关，尤其是HPV16和18型\[1，2\]。qPCR\|HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。qPCR\|HRM不受突变碱基位点与类型局限，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变分析。它是集高通量、高灵敏度、重复性好、操作简单和成本低多项优点于一体的一次PCR法的革新。本文对qPCR\|HRM技术用于HPV的检测进行可行性探讨和展望。1HPV感染的检测方法HPV传统的检测方法主要是通过形态学方法和免疫学方法进行检测。前者包括巴氏涂片细胞病理学检测、阴道镜检查、宫颈荧光检查以及宫颈活检组织病理学检查等。后者包括应用免疫组化法、采用放射免疫沉淀法、用血清免疫吸附实验（ELISA）等\[3\]。然而，在临床检测上传统检测方法的灵敏度和特异性均不够理想，其检测结果存在较高的假阳性和假阴性率，且不能对HPV进行分型。现如今，应用分子生物学方法进行HPV\|DNA的检测，包括基于核酸杂交的方法和基于PCR的方法。  核酸分子杂交技术的特异性和灵敏度均显著高于传统检测方法，既可以对HPV进行确诊，又可对HPV进行分型。核酸分子杂交技术有如下几种方法：Southern blot被认为HPV检测的金标准，该方法灵敏度高，理论上可检测1个病毒/细胞，适用于HPV分型、HPV\|DNA分子量鉴定、基因组酶切图谱建立及物理状态的研究等；斑点杂交是简化了的Southern blot。FDA已批准将此法应用于临床。斑点杂交能够检测包括14个HPV型别，分别为低危组的HPV\|6、11、42、43、44和中等/高危组的HPV\|16、18、31、33、35、45、51、52、56；此外，杂交俘获DNA分析是将高效的液相杂交方法和敏感的化学发光信号扩增系统相结合的检测方法。它能检测14种HPV型别，并且可对其定量，其灵敏度和特异性均较好，适用于HPV\|DNA的分型及定量分析\[4，5\]。在检测中发现，这些技术都存在着一些缺陷和弊端。Southern blot因为比较耗时且必须应用新鲜组织标本，目前还不便于临床应用。而斑点杂交虽已经批准可以用于临床检测，然其能够检测14个HPV型别相比HPV80多种已经完全鉴别的型别来说还是太少，同样，也存在比较耗时的缺点。杂交俘获DNA分析因为其存在交叉污染问题，临床上对该技术的应用比较慎重。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR法可检测出HPV\|DNA，还可进行基因分型，且具有较好的特异性和敏感性。此外，PCR法对标本来源不受限制，如病变组织或脱落细胞，分泌物或黏液，新鲜标本或保存已久的石蜡切片等标本均可\[6\]。最近，随着技术的改进，各种新的基于PCR的诊断方法不断涌现：分子信标引物扩增与反向杂交相结合的方法可用于HPV感染的大规模人群调查研究；而实时荧光分析是新近研发的基于实时PCR的5'外切核酸酶荧光探针HPV定量分析方法，主要针对HPV6、11、16、18这4个型别，能成功地用于检测新鲜标本、经Preserv Cyt固定的细胞以及宫颈样本，线性范围为10-1×107拷贝。该技术有高灵敏度和高特异性以及实时定量检测等优点；此外，间接原PCR（间接IS\|PCR）作为一种结合PCR方法与间接原位杂交两种技术用以检测巴氏涂片上的HPV\|DNA。其优点是所需细胞样本量少，可检测经PAP染色的标本并可保存涂片的细胞学特征。 用于HPV\|DNA检测的PCR新方法还有单管实时巢式PCR法和直接原位法等。2高分辨率熔解曲线分析（HRMA）的研究进展高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting analysis，HRMA）技术是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。HRMA是犹他州大学Witt\| wer实验室与美国Idaho公司联合研制的，是一种PCR后闭管操作技术：通过高密度荧光数据采集，直接用熔解曲线检测PCR扩增片段中微小序列差别，具有低成本、高通量、无污染、快捷、操作简单、不受变异位置影响、敏感性及特异性好等优势\[7\]。人们将这项新技术用于包括基因的突变筛查、基因分型、SSR分析和检测甲基化等。Krypuy M等率先用HRMA对卵巢癌（已知突变类型）、乳腺癌（未知突变类型）组织标本（各20例）的P53外显子5~8进行检测，与测序相比，其敏感度达100%、阳性预测值达91%以上\[8\]。Do等\[9\]将HRMA用于临床FFPE非小细胞肺癌标本KRAS外显子2突变检测，其敏感度为100%，特异度90%，相比测序法其工作量节省80%。至今，因HRMA具有易用性、高灵敏性与特异性、低成本、操作快捷等特点，外加HRMA是一个对DNA非破坏性的检测方法，而使得HRMA技术成为人类各种疾病相关的基因突变检测及临床分子诊断实验室使用的优选技术中新的“宠儿”。3讨论qPCR\|HRM技术正在迅速广泛应用于临床分子诊断实验室中，主要用于检测疾病相关的突变及分型。有关qPCR\|HRM技术用于HPV\|DNA检测的可行性：首先，在饱和荧光染料和高分辨率仪器在医学检验比较普及的前提下，在实时荧光定量PCR程序中加入一个从50~95℃的升温程序。运用qPCR\|HRM法检测HPV\|DNA并对其进行分析，显然是可以的。其次，根据目前已经完全鉴别到的HPV有80多种型，型与型之间差异在于基因结构的不同。而qPCR\|HRM法能够检测出其中一两个碱基的突变差异，用于HPV分型检测也在其检测参数范围之内\[5\]。最后，qPCR\|HRM可以直接通过PCR仪一步法进行HPV的筛查和分型。这展示了HRM用作一种较为理想的新型HPV\|DNA基因分型检测方法具有潜在的开发价值与应用前景，但未对其的准确性进行系统性评价。目前HPV 分型检测技术主要基于聚合酶链反应、核酸杂交与PCR结合法以及基因芯片技术。这些技术克服了传统细胞形态学只能定性不能分型以及敏感性低等缺陷，表现出高灵敏度、高特异性，可以进行多重感染检测等优点，但这些技术对实验条件要求高，检测费用也较高，不太适用于大量的临床检测和大规模的流行病学调查。近年发展的qPCR\|HRM技术具有高通量、高灵敏度、重复性好、操作简单和成本低等优点，已广泛应用于基因的突变扫描、HLA基因组配型和等位基因频率分析等。通过对HRM技术用于HPV\|DNA检测的可行性研究，在HRM技术需要饱和荧光染料、高分辨率仪器以及升温程序三个条件都可以满足的情况下，理论上qPCR\|HRM法对HPV进行检测分型是一种非常适合的方法，通过结合实时荧光定量和HRM法，就可以直接通过PCR仪一步法进行HPV的筛查和分型。

［9］Do H，Krypuy M，Mitchell PL，et al．High resolution melting analysis for rapid and sensitive EGFR and KRAS mutation detection in formalin fixed paraffin embedded biopsies\[J\]．BMC Cancer，2008，8：142．